• 引进新抗体（含更换克隆号）；

• 抗体批次更新；

• 抗体用途改变（老抗新用）；

• 试剂盒组分或染色条件发生改变；

• 由于商业机密的原因，抗体试剂和靶标抗原的基本特征和验证信息是不完整的。

• 技术员缺乏对抗体验证的正确认识，认为抗体验证是非必要部分。

• 不能正确进行组织前处理，后续的验证结果会受到影响。

• 二元策略：在含有阳性细胞和阴性细胞的同一组织样本切片上进行抗体验证。

• 范围策略：多个样本（高、中、低、无表达组织）同时进行验证评估。

• 正交策略：采用非IHC方法进行交叉对照，如原位杂交、RNA-seq等正交方法。

• 多种抗体策略：采用针对同一靶标抗原不同克隆号或相同染色模式的两种或多种抗体进行直接比较。

• 补充策略：抗体梯度稀释或相同组织的重复性实验结果的对比。

• 核对抗体说明书信息; 按照说明书确认剂型、规格、种属、样本类型、试剂有效期、存储条件和外包装等信息。

• 选择和设立对照组织；建议选择NordiQC、国际专家特设委员会（IAHEC）及人类蛋白质组网站（THPA）等推荐的正常组织表型参考，结合人类癌症基因组数据（TCGA）给出的疾病信息表型，采用实体肿瘤及周围正常组织来制作组织对照。操作上，可统一设立多组织羊膜卷（包含扁桃体、阑尾、肝脏、肾脏、胰腺、肺、前列腺、卵巢、胎盘等）或组织芯片裱贴在同张切片上，内含阴性和阳性对照组织。某些抗体需要同时设置阴性试剂对照。

• 染色条件摸索；新抗体根据说明书参数进行首次性能验证。批次更换的验证结果与首次验证结果不符时，需重新摸索抗体的最适条件。

• 性能特征观察；特异性：目的细胞有明确的定位与染色，其他细胞无染色视为抗体特异性良好。敏感性：通过不同程度表达的抗原组织染色，可观察到组织中抗原含量的上限和下限（参考IAHEC中18种抗体的染色下限标准）。重复性：观察相同组织多次的染色结果是否表达一致，完全一致视为重复性合格。

• 预期用途确认；选择应涵盖已知或金标准方法确认的阳性和阴性病例（1类3-10例，3类≥10例）进行结果确认。

• 结果记录与更新；保存验证结果记录于系列“IHC抗体性能验证表”中，批次改变或二抗和配套试剂组分、染色条件改变时予以更新、记录。

• 全流程环节验证；CNAS认可现场评审环节检查包括环境、试剂批次变更、人为错误、取材误差、仪器检定、抗原暴露、方法校准以及前处理不确定因素等，涉及实验室“人、机、料、法、环”要素构成，科室应依要求做好全流程的验证。

• 室间质评；室间质评或室间对比是抗体性能验证关键一环，通过各质控平台如CCPI的IHC质控活动验证合格的抗体，说明科室内部的验证参数与准确度可靠、可信。

• 临床反馈与调整；3类抗体全面性能验证合格后，才能用于临床检测和个性化用药指导。1类抗体及配套试剂通过设置同步对照及采用L‐J（Levey‐Jennings）曲线记录日常抗体染色情况进行分析和重新验证。

  
  

参考文献：

[1] 吴鸿雁,王婷,付尧等.免疫组织化学抗体的性能验证[J]. 中华病理学杂志 2020年49卷11期, 1214-1216页, MEDLINE ISTIC PKU CSCD, 2020.

[2] Uhlen M, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016 Oct;13(10):823-827.